Česko-švédský vědecký tým vyvinul novou metodu pro přesné stanovení malých molekul RNA mající velký potenciál v diagnostice a monitoringu léčby chorob, včetně rakoviny

MicroRNA jsou jednovláknové molekuly s délkou pouhých 22-24 nukleotidů mající často velmi podobnou sekvenci, která se může lišit pouze v jediné bázi. „MicroRNA představují nedávno objevenou třídu nekódujících RNA, které hrají klíčovou roli v post-transkripční regulaci genové exprese. Jsou přítomné nejen v tkáních, ale také v tělních tekutinách, kam mohou být transportovány jak pasivními, tak aktivními mechanismy,“ vysvětluje Mikael Kubista, vedoucí Laboratoře genové exprese v Biotechnologickém ústavu AV ČR – BIOCEV. „Detekce specifických microRNA v tělních tekutinách pak může být známkou onemocnění či jiných patologických situací dříve, než je jejich diagnostika možná s využitím konvenčních přístupů. Právě tato vlastnost učinila z microRNA velmi slibnou skupinu molekul s velkým diagnostickým potencionálem, tzv. biomarkerů,“ dodává Mikael Kubista. Jejich využití je také předmětem zájmu celoevropského projektu SPIDIA4P, který si klade za cíl standardizaci nástrojů a procesů pro in-vitro diagnostiku molekul a jejich následnou aplikaci v personalizované medicíně.

V současné době je k dispozici několik metod na měření microRNA pomocí kvantitativní PCR využívající standardní délku oligonukleotidů, tzv. primerů, mající délku 20-25 bazí. Využití takto dlouhých oligonukleotidů je možné díky prodloužení microRNA před samotnou jejich detekcí pomocí PCR, které je však často spojené s poklesem citlivosti a specificity stanovení. Nově představená technika Two-tailed PCR řeší tento problém využitím dvou krátkých sekvencí, tzv. hemi-prób, jež jsou součástí zmíněné unikátní struktury detekčního DNA oligonukleotidu. Délka jednotlivých hemiprób samostatně není dostatečná k efektivní vazbě microRNA molekul. Teprve kooperace obou sekvencí, které jsou propojeny ve struktuře vazebného DNA oligonukleotidu, poskytuje dostatečně stabilní a efektivní vazbu, která je základem vysoké sensitivity celého systému. Pokud se v místě vazby některé z obou hemiprób vyskytuje nepárující se nukleotid, tzv. mismatch, je síla vazby významně narušena a k vazbě takové microRNA nedojde, což poskytuje novému systému vysokou specificitu stanovení, tj. schopnost rozlišení miRNA molekul lišící se pouze jedním či více nukleotidy.

Two-tailed PCR byla během svého vývoje porovnávána s dalšími třemi systémy pro detekci microRNA, jenž využívají odlišný princip záchytu cílových molekul. Nová technika dosáhla vysoké sensitivity se schopností detekce méně jak 10 molekul microRNA ve vzorku, při současně nejvyšší míře specificity mezi testovanými systémy. Two-tailed PCR může být použita pro detekci jedné konkrétní microRNA, tak mnoha různých microRNA zároveň, což je častý případ při využití těchto molekul jako diagnostického cíle. Rovněž je možný způsob detekce využívající tzv. dvou- či jedno-zkumavkový formát, kdy veškeré nezbytné procesy probíhají s využitím minimálního počtu pipetovacích kroků. Nová technika je jednou z několika v současné době hodnocených metod pro detekci microRNA v tělních tekutinách v rámci evropského projektu pro boj s rakovinou Cancer-ID a podobného projektu řešící problematiku septických stavů Smartdiagnos. Pro zájemce o tuto novou technologii je v České republice nabízen kompletní servis zahrnující návrh, validaci nových esejí, případně i provedení měření v servisním pracovišti Gene Core v centru BIOCEV.

Více informací v publikaci: https://academic.oup.com/nar/article/3958703/Two-tailed-RT-qPCR-a-novel-method-for-highly

Publikace:

Androvic, P., Valihrach, L., Elling, J., Sjoback, R., Kubista, M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification. Nucleic Acids Research, gkx588, 2017. doi: 10.1093/nar/gkx588. ISSN 1362-4962.